Au-delà de la psilocybine psychédélique, le spectre métabolite des “champignons magiques” de l’espèce “Psilocybe” comprend des sesquiterpènes, une classe de produits naturels reconnus pour leurs bioactivités modulatrices de récepteurs. Cependant, la composition du profil sesquiterpénique est restée une question largement ouverte. Cette étude présente la caractérisation de cinq synthases de sesquiterpènes de Psilocybe cubensis, à la fois in vitro à l’aide d’enzymes produites par recombinaison et in vivo chez Aspergillus niger.
Le CubF est une synthase d’α-muurolol du clade I. Les synthases du clade IV examinées sont les synthases quasi-identiques CubG1 et CubG2, qui catalysent principalement la formation d’épi-isozizaène et de β-duprezianène. De plus, les CubH et CubI sont identifiées comme produisant principalement du dauca-4(11),8-diène et du β-barbatène, respectivement. Les analyses par chromatographie en phase gazeuse des composés volatils des mycéliums végétatifs et des corps fructifères de P. cubensis révèlent des différences qualitatives et quantitatives, le sterpurène étant parmi les principaux composés du mycélium et le dauca-4(11),8-diène dans les corps fructifères.
Cette connaissance fondamentale du terpenome de P. cubensis pourrait aider à distinguer les effets pharmacologiques des champignons magiques de ceux de la psilocybine pure.
Cette étude vise à approfondir la compréhension du terpenome de Psilocybe cubensis en caractérisant les synthases de sesquiterpènes sélectionnées des clades I et IV. Elle rapporte spécifiquement la caractérisation biochimique in vitro et in vivo de cinq synthases de sesquiterpènes. L’objectif ultime est d’acquérir une connaissance fondamentale qui pourrait aider à distinguer les effets pharmacologiques des champignons “magiques” de ceux de la psilocybine pure, en se basant sur leur composition en sesquiterpènes.
- Souches et milieux de culture : Les recherches utilisent la souche Psilocybe cubensis FSU12409, ainsi que des souches d’Aspergillus niger et d’Escherichia coli KRX pour la production hétérologue d’enzymes.
- Analyses phylogénétiques : La phylogénie des synthases de sesquiterpènes des clades I et IV est inférée à l’aide du serveur web IQTree, avec un alignement initial des séquences via ClustalW2 et une analyse de bootstrap ultra-rapide (UFBoot).
- Analyses par qRT-PCR : Les transcrits des gènes de sesquiterpènes synthases sont analysés par qRT-PCR sur des échantillons de mycélium et de corps fructifères de P. cubensis, afin de déterminer les niveaux d’expression génique.
- Construction de plasmides d’expression : Des plasmides pET28a (pour E. coli) et pPS01 (pour A. niger) sont construits pour l’expression hétérologue des gènes cubF, cubG1, cubG2, cubH et cubI.
- Production hétérologue d’enzymes : Les enzymes fusionnées N-terminalement avec une étiquette polyhistidine (CubF-CubI) sont produites et purifiées à partir de cultures d’E. coli KRX transformées.
- Tests de formation de produits in vitro : Les enzymes CubF-CubI purifiées sont incubées avec du FPP (farnésyl-diphosphate) ou du GPP (géranyl-diphosphate) comme substrats, et les produits formés sont analysés par GC-SM (chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse).
- Expression de transgènes chez A. niger : Des protoplastes d’A. niger sont transformés avec les plasmides d’expression, et l’intégration des gènes est vérifiée par PCR. L’expression des transgènes est induite par la doxycycline.
- Extraction des cultures d’Aspergillus : Les extraits mycéliens d’A. niger sont préparés par extraction au n-hexane pour l’analyse chromatographique.
- Microextraction en phase solide (SPME) : Les terpènes volatils émis par le mycélium végétatif et les corps fructifères de P. cubensis sont analysés par SPME, y compris après traitement avec des enzymes de lyse.
- Analyses par GC-SM : Les produits des essais in vitro et les échantillons d’espace de tête SPME sont analysés à l’aide d’un système ISQ GC-SM, et les composés sont identifiés par comparaison avec des bases de données et la littérature.
- Synthases de sesquiterpènes de Psilocybe cubensis : L’étude montre que P. cubensis encode des synthases de sesquiterpènes actives appartenant aux quatre principaux clades (I-IV). Certaines synthases sont conservées chez d’autres espèces de Psilocybe, tandis que d’autres semblent spécifiques à l’espèce.
- Caractérisation de CubF (Clade I) :
- In vitro : La CubF, synthase d’α-muurolol, catalyse la formation de quatre produits de sesquiterpènes : le β-élémène, l’α-muurolène, le germacrène D-4-ol et l’α-muurolol (produit majeur à 72,7 %).
- In vivo (chez A. niger) : L’α-muurolol reste le produit dominant (57,8 %), avec la détection supplémentaire de γ-muurolène, de δ-cadinène, de τ-muurolol et d’α-cadinol, enrichissant le métabolome secondaire de Psilocybe.
- Caractérisation de CubG1 et CubG2 (Clade IV) :
- CubG1 in vitro : Le produit majeur est l’épi-isozizaène (67,4 %), accompagné de β-cédrène et d’acora-3,5-diène.
- CubG1 in vivo (chez A. niger) : Le profil correspond à l’essai in vitro, avec l’épi-isozizaène comme produit dominant (53,3 %).
- CubG2 in vitro : Les produits majeurs sont l’acorénol (46,3 %) et le β-duprézianène (13,9 %), ainsi que le β-cédrène et l’acora-3,5-diène.
- CubG2 in vivo (chez A. niger) : L’acorénol n’est pas détecté, mais le β-duprézianène est le produit le plus abondant (26,6 %), suivi du β-cédrène et de l’acora-3,5-diène. Le (Z)-α-bisabolène est également présent.
- Caractérisation de CubH (Clade IV) :
- In vitro : Le produit principal est le dauca-4(11),8-diène (83,1 %), avec des traces de (Z)-α-bisabolène et de daucène.
- In vivo (chez A. niger) : Le dauca-4(11),8-diène reste le produit prédominant (72,8 %), avec la détection supplémentaire de (E)-γ-bisabolène.
- Caractérisation de CubI (Clade IV) :
- In vitro : Le β-barbatène est le produit quasi-exclusif (90,9 %), avec de petites quantités de β-himachalène.
- In vivo (chez A. niger) : Le β-barbatène est le composé dominant (76,7 %), accompagnée de β-himachalène, d’α-barbatène, d’isobazzanène et d’α-chamigrène.
- Analyse des composés volatils (espace de tête) :
- Mycélium non traité : Le sterpurène est le composé majeur, avec la présence de β-cédrène, d’acora-3,5-diène et de β-duprézianène.
- Mycélium endommagé : Le sterpurène reste majoritaire, et le néotrifaradiène devient le deuxième produit principal.
- Corps fructifères non traités : Le dauca-4(11),8-diène (58,0 %) et le (Z)-α-bisabolène (14,8 %) sont les principaux composants.
- Corps fructifères endommagés : Le dauca-4(11),8-diène est présent, mais le β-barbatène devient quantitativement dominant (70,6 %).
Cette étude, combinée aux recherches antérieures, achève un inventaire complet de la capacité biosynthétique de P. cubensis à produire des sesquiterpènes et des terpénoïdes. L’espèce encode des synthases de sesquiterpènes actives issues des quatre principaux clades (I-IV). L’étude révèle que certaines synthases sont présentes chez d’autres espèces de Psilocybe, tandis que d’autres semblent spécifiques à P. cubensis, suggérant des différences qualitatives dans le répertoire de sesquiterpènes entre les espèces.
Les résultats apportent des éclaircissements sur le métabolome secondaire non alcaloïde des champignons psychédéliques. L’étude conclut que ses données peuvent aider à expliquer la base chimique de “l’effet d’entourage” et, plus généralement, à aborder la question complexe et encore ouverte de la mesure dans laquelle les effets pharmacologiques des champignons producteurs de psilocybine, potentiellement spécifiques à l’espèce, diffèrent de ceux exercés par la psilocybine pure.
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