La biosynthèse stable et à haut niveau de produits naturels complexes exige un contrôle précis de l’expression hétérologue des voies, mais les architectures transcriptionnelles optimisées sur plasmides échouent souvent lorsqu’elles sont transférées au chromosome. L’étude présente ePathIntegrate, une stratégie d’ingénierie des voies centrée sur le génome qui exploite les transposases associées à CRISPR (CASTs) pour intégrer et rééquilibrer des voies métaboliques multigènes chez Escherichia coli.
Le transfert génomique direct des voies de la psilocybine et de la N,N-diméthyltryptamine (DMT) optimisées sur plasmide entraîne une perte de productivité, due à un comportement de promoteur dépendant du contexte. Pour y remédier, les chercheurs développent et caractérisent une bibliothèque de promoteurs T7 mutants qui restaurent un contrôle transcriptionnel de moyenne portée sur le génome.
L’application d’ePathIntegrate permet la réoptimisation des deux voies, produisant des souches génomiques qui atteignent 1,88 g/L de psilocybine et 1,62 g/L de la DMT dans des bioréacteurs à alimentation continue. Le séquençage du génome entier des souches médiatisées par CAST révèle en outre (i) une intégration précise sur cible, (ii) certaines intégrations hors cible de la voie, et (iii) de petites mutations dans un sous-ensemble de souches, soulignant à la fois la puissance et les limitations de l’ingénierie de souches médiatisée par CAST.
Cette étude vise à présenter ePathIntegrate, une stratégie d’ingénierie des voies métaboliques centrée sur le génome, et à l’appliquer à l’optimisation des voies de biosynthèse de la psilocybine et de la DMT chez E. coli.
Elle a pour objectif d’adresser la perte de productivité observée lors du transfert de voies optimisées sur plasmide vers le génome, de développer une bibliothèque de promoteurs T7 mutants pour un contrôle transcriptionnel équilibré, et d’atteindre des titres de production record pour la psilocybine et de la DMT.
Les auteurs cherchent également à élucider les mécanismes d’intégration des CASTs et à identifier leurs forces et limitations en matière d’ingénierie de souches.
- Souches bactériennes et milieux : E. coli DH5a est utilisée pour la propagation des plasmides et le clonage. BL21 star™ (DE3) sert de souche hôte pour les expériences de production chimique. Le milieu AMM (Andrew’s Magic Media) est employé pour toutes les expériences de production.
- Construction des vecteurs pEffector : Des séquences d’ARN CRISPR (crRNA) sont sélectionnées pour permettre l’intégration à des emplacements génomiques spécifiques. Les crRNA-1 (glmS), crRNA-4 (lacZ), crRNA-13 (tktB-ypfG) et crRNA-17 (yadD-panC) sont utilisées.
- Construction des vecteurs pDonor et système ePathIntegrate : L’ADN pDonor est digéré avec des enzymes de restriction XhoI et PstI. L’ADN de charge utile est amplifié avec environ 25 paires de bases d’homologie pour l’assemblage Gibson. Le système ePathIntegrate étend les systèmes de vecteurs ePathBrick et ePathOptimize.
- Intégration de l’ADN donneur : 50 ng de pEffector et 200-400 ng de pDonor sont co-transformés dans des cellules BL21Star™ (DE3) chimiquement compétentes. La détection de l’intégration de l’ADN de charge utile s’effectue par PCR sur colonie.
- Création et caractérisation de la bibliothèque de promoteurs mutants : Une bibliothèque de promoteurs mutants T7 (Z70, Z55, Z35, Z15) est créée à l’aide de techniques de mutagénèse dirigée, avec évaluation de l’expression de mCherry.
- Méthodes analytiques : Les métabolites sont analysés par HPLC (Chromatographie Liquide Haute Performance) et LC-MS (Chromatographie Liquide-Spectrométrie de Masse). La quantification des sucres et acides organiques est réalisée par colonne Bio-Rad Aminex HPX-87H.
- Performance des souches : Le transfert direct des voies de la psilocybine et de la DMT optimisées sur plasmide vers le génome entraîne une perte de productivité, attribuée au comportement dépendant du contexte des promoteurs.
- Développement de promoteurs mutants T7 : Une bibliothèque de promoteurs T7 mutants est développée et caractérisée, permettant de restaurer un contrôle transcriptionnel de moyenne portée sur le génome. Ces promoteurs corrigent l’écart de performance observé entre l’expression sur plasmide et sur génome.
- Titres de production : Les souches génomiques optimisées avec ePathIntegrate atteignent 1,88 g/L de psilocybine et 1,62 g/L de la DMT dans des bioréacteurs à alimentation continue. Ces chiffres représentent les titres de production les plus élevés rapportés à ce jour pour la la DMT dans un système recombinant et surpassent les performances antérieures basées sur plasmide pour la psilocybine.
- Analyse du génome : Le séquençage du génome entier révèle une intégration précise sur cible, mais aussi des intégrations hors cible de certaines voies et de petites mutations dans un sous-ensemble de souches.
- Mutations courantes : Deux gènes, rne et gltS, sont identifiés comme fréquemment mutés. Des mutations par décalage de cadre dans rne sont observées dans plus de la moitié des souches séquencées, et des mutations dans gltS sont présentes dans cinq souches de psilocybine.
Ce travail met en évidence le premier rapport utilisant les CASTs pour intégrer et équilibrer métaboliquement les voies hétérologues fonctionnelles dans le génome d’E. coli, ce qui a permis d’obtenir des métriques de production égales ou supérieures aux rapports les plus élevés des systèmes basés sur plasmide.
L’étude suggère que les promoteurs offrant une large gamme d’expression fonctionnelle dans un système basé sur plasmide ne garantissent pas nécessairement une gamme d’expression fonctionnelle similaire dans un contexte d’expression basée sur le génome.
Les données recueillies semblent contredire les conclusions de publications antérieures, car les forces d’expression fonctionnelle des constructions mCherry ne semblent pas changer considérablement selon les différents emplacements génomiques.
L’approche ePathIntegrate, bien que chronophage, s’avère efficace pour identifier des souches d’élite capables de performances de haut niveau. Les travaux futurs doivent explorer le moment et l’impact des mutations sur le phénotype des souches, et des efforts supplémentaires sont nécessaires pour sélectionner et cribler les bibliothèques de souches afin d’identifier les souches intégrées les plus performantes, compte tenu du taux de mutation élevé.
En conclusion, l’application de cette approche d’équilibrage des voies basée sur le génome aux voies de la psilocybine et de la DMT a permis d’atteindre des performances à l’échelle du gramme dans chaque cas, égalant ou dépassant les titres maximaux de produit biosynthétique pour chaque produit cible rapporté dans la littérature.
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