Cette étude présente une caractérisation complète de l’enzyme humaine INMT, impliquée dans la biosynthèse de la DMT, par des analyses enzymatiques continues (fluorométrie), thermiques (TSA) et de modélisation moléculaire. Une méthode utilisant la quinoline comme substrat permet de suivre l’activité enzymatique en temps réel, une première dans ce domaine. Les analyses montrent des conditions optimales de stabilité de l’INMT et précisent les constantes de dissociation (Kd) de ses coenzymes naturels, SAM et SAH. Le docking moléculaire révèle que la quinoline et le tryptamine partagent le même site de liaison. Cette approche ouvre des perspectives pour l’étude des mutants enzymatiques et de leurs liens potentiels avec des maladies psychiatriques.
Développer une méthode fiable et continue pour l’analyse de l’activité de l’INMT humain, en déterminant ses caractéristiques cinétiques et structurales, et en explorant ses interactions moléculaires avec des substrats naturels et artificiels.
- Clonage et expression hétérologue de l’INMT humain dans E. coli.
- Purification de la protéine et mesure de son activité par fluorescence avec quinoline.
- Analyses de stabilité thermique (TSA) pour évaluer les conditions optimales et déterminer les Kd de SAM et SAH.
- Études de docking computationnel avec HADDOCK et PLIP pour modéliser les interactions avec tryptamine et quinoline.
- La méthode fluorométrique permet de mesurer l’activité de l’INMT avec un bon degré de précision.
- Les constantes cinétiques KM et kcat pour la quinoline et le SAM sont établies.
- SAM et SAH se lient à l’INMT avec des Kd dans la gamme micromolaire (~55 µM).
- Le tryptamine inhibe l’activité de l’INMT sur la quinoline.
- Le site actif est partagé par la quinoline et le tryptamine, selon les analyses de docking.
- L’enzyme présente une double transition thermique, liée à sa structure instable et potentiellement à des ponts disulfure internes.
Cette méthode ouvre la voie à l’étude de mutations de l’INMT humain potentiellement liées à des troubles psychiatriques comme la schizophrénie, en améliorant la compréhension des relations structure-fonction. Elle facilite aussi le criblage d’inhibiteurs ou de cofacteurs et l’étude de la DMT endogène.
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